INSERM UMR 1089 : Translational Gene Therapy for Retinal & Neuromuscular Diseases

Février 2011 à juillet 2012

Missions effectuées

  • Constructions de plasmides pour la production d’AAV recombinants, pour l’établissement de lignées cellulaires stables par recombinaison site spécifique, et pour l’optimisation de techniques de détection
  • Contrôle qualité des productions adénovirales et des constructions plasmidiques pour la production d’AAV recombinants
  • Organisation informatique et documentaire de la gestion et de l’utilisation des banques de matériel génétique (VectorNTI)
  • Accompagnement des clients pour leurs productions d’AAV recombinant

Détails de l’expérience

  • Construction de plasmides pour la production de virus adéno-associés recombinants (rAAV) pour le compte de clients divers, externes ou internes, par différentes techniques de clonage (Restriction, PCR, Ligase-free, Auto-Assemblage)
  • Accompagnement des clients internes et externes dans leurs démarches de production d’AAV recombinant. Propositions de solutions techniques depuis le design du vecteur jusqu’à la production du plasmide vecteur.
  • Construction de plasmides pour l’établissement de lignées productrices stables par intégration site spécifique d’un AAV recombinant reporteur au sein du génome des cellules. L’AAV reporteur est également flanqué d’autres régions de recombinaison homologue permettant, une fois l’intégration effectuée, d’échanger l’AAV reporteur avec un autre AAV recombinant afin de faire produire ce dernier par les cellules de manière endogène.
  • Construction de plasmides pour la mise au point de techniques de détection de génomes AAV après production.
    Les polymérases utilisées pour la PCR sont fortement entravées par la structure secondaire des Inverted Terminal Repeats (ITR) de l’AAV. Les plasmides construits permettent la production de fragments d’ADN de tailles diverses, contenant ou non la séquence des ITRs, permettant l’étude de l’impact de leur présence sur la capacité des polymérases à amplifier fidèlement ces fragments.
  • Construction de plasmides pour la production de virus de type « Dual AAV ». Un transgène est coupé en 2 parties « Tête » et « Queue », flanquées en 3′ pour la partie Tête et en 5′ pour la partie Queue d’une séquence de recombinaison homologue, et clonées chacune dans des virus différents. Après infection d’une cellule par les 2 virus, ceux-ci se recombinent pour reconstituer le transgène dans sa totalité et permettre son expression
  • Organisation physique, informatique (par Vector NTI) et documentaire des banques de plasmides :
    • Stockage : pour permettre la conservation à long terme des plasmides les plus importants du laboratoire.
    • Travail : pour mettre en commun toutes les caractéristiques des plasmides (promoteur, polyA, gène de résistance, sites de restriction utilisables …) couramment utilisés pour les clonages, facilitant le travail des cloneurs en leur donnant tous les outils à disposition pour réaliser les stratégies de clonages les plus efficaces.
  • Contrôle qualité des productions adénovirales (validation de l’efficacité d’infection des préparations). Contrôle de la stabilité phénotypique des lignées cellulaires productrices. Contrôle qualité des plasmides vecteurs clients avant production d’AAV.

Description de l’entreprise

l’UMR1089 est un des plateaux techniques de l’Institut de Recherche Thérapeutique de l’Université de Nantes (IRT-UN). Il assure la production de lots de grade clinique de virus adéno-associés (AAV) recombinants, notamment dans le cadre d’essais cliniques de thérapie génique. L’unité s’organise en trois groupes :

  • 2 équipes de recherche qui développent des protocoles de transfert de gènes in vivo appliqués à des maladies de la rétine (amaurose congénitale de Leber) et à des maladies neuromusculaires (amyotrophie spinale et myopathie de Duchenne). Dans chaque modèle, un intérêt particulier est porté à l’efficacité du transfert de gène en fonction du mode d’administration utilisé, mais aussi à l’étude de la réponse immune associée ou non, et à la structure in vivo prise par le vecteur viral utilisé et son devenir.
  • Une équipe de R & D qui développe de nouveaux outils de production, des procédés de purification compatibles avec la production de vecteurs de grade clinique ainsi que la mise au point de tests de contrôle qualité pour une application clinique. Le but étant de pouvoir transférer ces développements vers la plate-forme Atlantic Bio GMP.
  • Une plate-forme de production de vecteurs viraux pré-cliniques.

Site web de l’entreprise

http://www.vectors.univ-nantes.fr/